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把爱洒满人间的博客

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酶切后产生的末端发生任意连接是什么意思?  

2014-02-13 10:33:23|  分类: 现代生物科技 |  标签: |举报 |字号 订阅

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构建体外重组DNA分子,即是将目的基因与相应的载体用特定的限制酶切割后再通过体外连接形成一完整的DNA分子。因此,首先要了解目的基因及其相应载体的酶切图谱。其次,为保证酶切后目的基因片段的完整性,不论是化学合成的基因还是分离自生物体的天然基因,在目的基因内部都不能出现选用限制性内切酶的序列位点。在设计构建策略时,最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解,产生两个不同的粘性末端。再用这两种相同的限制性内切酶对合适的载体进行酶切,也产生相同的粘性末端,这样构建的重组DNA分子,目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的,重组的效率较高,也易于筛选出重组子。如果目的基因DNA片段只能用一种限制性内切酶进行切割,产生平末端或粘性末端,那么选择的载体也要同样的限制性内切酶进行酶切,这样构建的重组DNA分子,目的基因DNA片段以两个方向插入质粒载体中,甚至目的基因DNA串连以后再插入载体中,同时载体也有可能自连(这种机会往往较多),因而重组效率较差。筛选重组子较两种不同限制性内切酶构建的重组DNA分子工作量大些。我们实验的目的是要构建第一种类型的体外重组DNA分子,即用两个不同的限制酶切割,在目的基因和载体片段两端分别产生两个不同的粘性末端。 本实验所用的目的基因Hal1已克隆在质粒载体pGEM-T中,含目的基因的质粒称为pHal1。该目的基因两端分别含有BamHI和EcoRI酶切位点,用这两个酶切割后可产生两个线性DNA片段,一个为质粒载体pGEM-T所形成的线性DNA片段,另一个即是我们所需要的1.0kb长的目的基因Hal1片段。另一个载体pGEX-6P-1为表达性质粒载体,其中含有一个多克隆位点,也具有BamHI和EcoRI两个酶切位点,经这两个酶消化后,可产生线性的载体DNA片段;在这一载体中多克隆位点的两端分别含有SP6和T7基因启子,可驱使克隆入多克隆位点中的目的基因在原核生物如大肠杆菌中表达。本实验的目的是用双酶切目的基因和表达性质粒载体后,鉴定酶切的结果。酶切后产生的目的基因片段和载体DNA片段可用于随后的实验中(DNA分子的体外连接)。

这里的为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接就是为了防止目的基因DNA片段以两个方向插入质粒载体中的意思.
用不同的限制酶切割载体或DNA,而且两末端结构不同,那么目的基因只能按一种方向连接在载体上(也就是说目的基因和质粒表达载体产生的末端不能发生任意连接),这种模式被广泛应用。
如果用载体和目的基因都用一种酶切(如用EcoRI切),则目的基因与载体的连接方式有2种(的基因和质粒表达载体产生的末端能发生任意连接)
 
如果载体用2种酶切,目的基因也用2种酶切,则目的基因与载体的末端不能任意连接,只有一种插入方向:(的基因和质粒表达载体产生的末端不能发生任意连接)
 
可是我的疑惑还有:如果只用一种限制酶切割目的基因片段和质粒,切割后的目的基因可以两种方向(一种正常顺序,一种是反向插入)插入质粒,有什么影响吗?同样都是同一个基因,翻译出来的蛋白质序列不还是一样吗?难道一个基因顺序颠倒了,就不能转录和翻译了?或者翻译的蛋白质和原来的就不一样了?请一江秋水斑竹帮忙解释,谢谢
2014年02月13日 - 十年磨砺 - 把爱洒满人间的博客
 
即:
反义RNA会造成干扰。
(注意,不是为了防止自连,大家看下图,用两只不同的酶切后还是可以自连的)
酶切后产生的末端发生任意连接是什么意思? - 十年磨砺 - 把爱洒满人间的博客
 
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